Revista Medicina Materno Fetala
Cautare: Cauta articole medicina
Abonare: Abonare articole medicina ginecologie
Centrul Medical Promed System
Articole medicina reproducere asistata
Articole inseminare in vitro

Ultimele articole


Partener oficial

Articole medicina obstetrica si ginecologie
Centrul Medical Promed System
 

Medicina materno-fetala » Genetica medicala » Importanta reactiei de polimerizare in lant in diagnosticul prenatal

Reactia de polimerizare in lant (PCR) a fost pusa la punct la inceputul anilor '80 de catre Kary Mullis care a primit de altfel si premiul Nobel pentru medicina deoarece aceasta tehnica a reusit sa revolutioneze studiul molecular avand aplicabilitate larga in domenii din ce in ce mai diverse : genetica, microbiologie, virusologie, hematologie, oncologie etc.

Reactia de polimerizare in lant-principii


-consta in amplificarea selectiva a unei secvente de ADN - printr-o succesiune de cicluri de amplificare fiecare ciclu avand la randul sau trei etape

1)denaturarea lanturilor de ADN care in vivo se face enzimatic in vitro se face termic prin incalzirea ADN la 96 grade Celsius

2)anealing respectiv delimitarea genei de amplificat cu ajutorul unor secvente scurte de aproximativ 20-25 perechi de baze de ADN complementar numite primer sens si antisens care are loc la o temperatura care se calculeaza in functie de structura primerilor

3)extensia respective polimerizarea propriu zisa in care ADN polimeraza numita Taq cu ajutorul bazelor puse in mediul de reactie (ATCG) pe modelul genei delimitate construieste copii identice ale genei analizate

-initial la mijlocul anilor 80 cand a fost pusa la punct tehnica polimerizarii in lant se folosea ca enzima de amplificare o polimeraza extrasa din E. Coli care trebuia adaugata fiecarui ciclu de amplificare deoarece la etapa de denaturare enzima la 96 de grade se coagula fiind inactivata

-ulterior aceasta bariera a fost eliminata prin sinteza polimerazei unei bacterii care traieste in gheizere astfel incat la 96 de grade enzima ramane stabila deci nu mai era adaugata la fiecare ciclu de amplificare fiind pusa la inceput in reactie

-la sfarsitul reactiei se obtine un numar foarte mare de gene identice cu cea initiala prin reproducerea sa exponentiala.De ex: de la o gena dupa 20 de cicluri de amplificare se obtin 262144 de copii identice numite ampliconi ,la 32 de cicluri se obtin 1073741824 copii identice ,la 45 de cicluri de amplificare numarul de ampliconi este de 2 la puterea 44 +1 copii identice practic un numar cu peste 18 cifre

Produsul de amplificare este pus sa migreze intr-un gel de agaroza 2% cu ethidium bromid alaturi de un marker molecular cu greutate moleculara deja cunoscuta si vizualizat cu ajutorul unei lampe UV.Imaginea genei o reprezinta o banda care se opreste in dreptul greutatii sale moleculare

Utilizarea PCR in diagnosticul prenatal


Diagnosticul prenatal are importanta pentru starea de sanatate a mamei dar mai ales a fatului acesta putind fii purtatorul unor afectiuni grave care-i pun in pericol atat calitatea vietii postpartum cat si viata in sine.

Fatul poate fi purtatorul unor afectiuni mostenite de la parinti ,purtator de novo a unei anomalii cromozomiale sau la nivel de gena, materialul sau genetic poate fii modificat cu aparitia unor grave malformatii dupa infectii dobandite in timpul sarcinii toate avand ca substrat anomalii numerice sau structurale ale cromozomilor si modificari ale genelor.

Studiul acestor afectiuni cu rasunet cromozomial s-a facut mult timp prin metoda cariotiparii care consta in prelevarea lichidului amniotic si punerea acestuia in mediu de cultura cu obtinerea de metafaze si studierea lor. Metoda este eficienta si inca isi mentine actualitatea dar prezinta o serie de dezavantaje –timpul indelungat pana la rezultate –in medie doua saptamani,sensibilitatea si specificitatea relativ redusa a acestei metode in comparatie cu noile metode de studiu molecular,aceasta metoda da informatii numai despre anomaliile cromozomiale fara sa poata da informatii despre modificarile aparute la nivelul genelor.

Pe parcursul timpului dezvoltarea tehnicilor de biologie moleculara si-a gasit aplicabilitatea si in diagnosticul prenatal.Tehnica care a urmat cariotiparii este tehnica FISH care a fost folosita pentru prima data in 1988 . Aceasta tehnica foloseste sonde fluorescente specifice cromozomului care trebuie studiat.

Aceasta tehnica s-a dovedit mult mai eficienta in diagnosticul prenatal al anomaliilor cromozomiale astfel incat numarul afectiunilor care pot fii decelate prenatal a crescut foarte mult.

La inceputul anilor 90 evolutia tehnicii PCR si-a gasit aplicabilitate si in domeniul diagnosticului prenatal prin aceasta tehnica se pot analiza nu numai la nivel cromozomial dar se poate merge mai profund pana la nivelul genelor.

S-au diagnosticat si tehnicile de recoltare a materialului biologic dar amniocenteza ramane metoda care furnizeaza in pricipal materialul de studiu.

Principalele indicatii de amniocenteza sunt (dupa 8)

-anomalii ecografice ale fatului

-anomalii cromozomiale la sarcini anterioare

-anxietatea materna

-varsta –dupa 35 de ani

-daca unul din parinti este purtatorul unei afectiuni cu potential de transmitere genetica

-infectia materna in timpul sarcinii cu virusi ex CMV

-nivele crescute serice ale markerilor din sangele matern pentru afectiuni congenitale –triplul test

S-au dezvoltat si tehnicile de prelevare a materialului biologic, azi se poate lucra nu numai pe lichidul amniotic obtinut prin amniocenteza care reprezinta inca principalul material de studiu dar actual se pot folosi prelevatul din vilozitatile coriale,sangele din cordonul ombilical.

Folosirea PCR in diagnosticul prenatal poate fi utila in

1) determinarea anomaliilor cromozomiale –prima aplicatie

2) in diagnosticul patologiei infectioase de sarcina care poate determina modificari la nivelul fatului

3) in decelarea unor boli congenitale s-au dobandite cu substrat genetic .

1)Aplicarea PCR in diagnosticul prenatal al modificarilor cromozomiale a fost facuta pentru prima data in 1991 cand s-au decelat anomalii ale cromozomului X.Tehnica a fost ulterior perfectionata de Mansfield (dupa 4 ) astfel incat s-a reusit determinarea trisomiilor 21,18,X,Y materialul de studiu a fost prelevat din lichid aminitic,vilozitati corionice ,sange fetal.Din 1995 s-a pus la punct tehnica multiplex -PCR care permite determinarea simultan a mai multor anomalii cromozomiale.Actual se foloseste cel mai frecvent lichidul amniotic pentru PCR asa numitul amnio-PCR.Din celulele isolate din lichidul amniotic se extrage ADN-ul care apoi este folosit in reactia PCR.Pentru o mai buna apreciere a ADN-ului se foloseste actual tehnica de PCR cantitativ asa numitul Q-PCR care permite atat diagnostic calitativ dar si diagnostic cantitativ.

Cele mai frecvente anomalii cromozomiale diagnosticabile prenatal sunt aneuploidiile de tip :

-trisomia 21 (sindromul Down)

-trisomia 18(sindromul Patau),

-aneuploidiile cromozomului X :sindromul Turner 45X,trisomia cromozomului X,sindromul Klinefelter 47 XXY,

-aneuploidiile cromozomului Y:sindromul XYY –47 XYY

-toate acestea reprezinta un procent de 95% din anomaliile cromozomiale ale noului nascut (dupa 3).

Tabelul 1(dupa 1)

Avantaje si dezavantaje ale tehnicilor moleculare in diagnosticul prenatal


FISH PCR
Avantaje anticipate -analiza completa in 24-48 de ore   -capabila sa studieze cinci din cele mai frecvente anomalii cromozomiale numerice (21,13,18,X,Y) -analiza completa in 24-48 ore -interpretare cantitativa mai putin subiectiva decat FISH                         -mai putin laborioasa decat FISH         -grad mai mare de automatizare
Dezavantaje -interpretarea rezultatelor este subiectiva -mai laborioasa in acelasi interval de timp decat Q-PCR                                     -grad mai mic de automatizare              -nu determina anomalii structurale ale cromozomilor -aplicarea pentru diagnosticele de aneuploidie este mai limitata          -costuri mai mari decat FISH


Tehnica PCR folosita in diagnosticul prenatal deceleaza mai mult decat modificari cromozomiale ajungand pana la studiul genelor astfel incat este mult largita gama de afectiuni diagnosticabile prenatal cu potential malformativ sau capabile sa determine boli postpartum.

2) Un rol important il ocupa actual PCR-ul in diagnosticul patologiei infectioase de sarcina care poate fii virala si mai putin importanta cu rol malformativ infectiile bacteriene,parazitare.

Cele mai frecvente infectii virale contactate in timpul sarcinii si care pot sa aiba repercusiuni asupra produsului de conceptie sunt:infectia cu citomegalovirul (CMV),parvovirusul B19,virusul rubeolei si virusul varicelozosterian(dupa 2 ).Infectiile virale determina aparitia anticorpilor si prezenta acestora poate fii detectata prin probe serologice dar metoda serologica nu permite un diagnostic foarte precoce si sensibilitatea acestor metode nu depaseste sensibilitatea metodelor moleculare-mai ales PCR.De asemenea metodele serologice dau informatii despre infectia activa materna dar nu dau nici o informatie despre infectarea virala a produsului de conceptie deoarece infectia materna nu implica obligatoriu infectia fetala.

Dintre aceste infectii virale contactate in timpul sarcinii un loc aparte il ocupa infectia cu citomegalovirus (CMV).Aceasta este cea mai comuna cauza de infectie congenitala(dupa 3)de ex in Statele Unite aproximativ 1% din noi nascuti secreta CMV iar din acestia 10% au afectarea starii de sanatate cele mai comune manifestari fiind:diminuarea cresterii intrauterine,trombopenie,microcefalie,deficite neurologice ,calcificari intracraniene.

Infectia primara cu CMV in timpul sarcinii este mai agresiva asupra produsului de conceptie decat o reactivare a unei infectii latente sau reinfectia.In timpul sarcinii procentul de transmitere a infectiei primare de la mama la fat este de 40% pe cand mamele la care virusul este reactivat sau infectia este latenta transmit infectia produsului de conceptie in procent de 2%.

Prin metoda amnio-PCR este pus in evidenta prezenta citomegalovirusului in lichidul amniotic si implicit infectarea fetala chiar daca acesta e in cantitate mica putandu-se lua decizii in ceea ce priveste produsul de conceptie.

Imaginea de mai sus evidentiaza prezenta citomegalovirusului in lichidul amniotic obtinut prin PCR (dupa 3)

Un alt virus capabil sa determine afectiuni ale fatului prin infectie materna este virusul rubeolei .

Infectia materna in prima parte a sarcinii cu virusul rubeolei si care se poate transmite fatului determina asa numitul sindrom Gregg caracterizat prin cataracta congenitala,anomalii cardiovasculare,endocrinopatie tip diabet zaharat.

Prin amnio-PCR se poate determina contaminarea fetala care poate avea repercusiuni asupra starii de sanatate si se poate lua o decizie in ceea ce priveste mentinerea sarcinii.

3) Dintre afectiunile cu substrat genetic capabile sa determine boli ale fatului care sunt diagnosticabile cu ajutorul PCR sunt de de mentionat

-deficitul de factori VIII,IX respective hemofiliile –afectiuni care au transmitere recesiva legate de sex;locul genei globulinoformatoare este pe cromozomul X,aceasta dispozitie face ca baietii care poseda un singur vromozom X sa fie hemizigoti pentru aceasta tara si sa faca boala putind transmite descendentilor de sex feminine numai tara,femeia este heterozigota fata de tara ea nu face in mod obisnuit boala deoarece alela sanatoasa este dominanta in schimb poate transmite descendentilor sai fie boala –baietilor fie tara –fetelor:,metoda PCR este capabila sa determine expresia genei care este raspunzatoare de sinteza factorilor VIII si IX care se gasesc pe cromozomul X;locul genei si sa identifice femeile purtatoare ale tarei care sunt capabile astfel sa transmita afectiunea fetilor de sex masculine.

Figure 1. Prenatal diagnosis of hemophilia A by nested PCR analysis. Lane 1: undigested 142 bp fragment. Lane 2: villus, after Bcl-I enzymatic digestion, shows the (99+42) fragments. Lane 3: mother; lane 4: 100 bp ladder DNA marker

Figura de mai sus evidentiaza diagnosticul prenatal al hemofiliei A prin PCR,linia 1 arata banda de 142 de bp a fatului,linia 2 aspectul benzii dupa digestia enzimatica ,linia 3 banda corespunzatoare mamei,linia 4 este markerul molecular standard folosit(dupa 11)

Bibliografie


1) Evaluation of molecular tests for prenatal diagnosis of chromosome abnormalities

Grimshaw GM,Scezepura A.,Hulten M.,MacDonald F.,Health Technol Assess 2003(1-146)

2) Molecular diagnosis of viral materno-fetal infections,Grangeot-Keros L.,Ann.Pharm Fr.2003 ,61(4),259-64

3) Development and application of a PCR-based method including an internal control for diagnosis of congenital Cytomegalovirus infection,R. Jones,L. Neale,B.Beattie,D. Westmoreland,J.Fox,Journal of Clinical Microbiology 2000,1-6

4) Developments in laboratory techniques for prenatal diagnosis,

Miny P.,Tercanli S.,Holzgreve W.,Curr Opin Obstet Gynecol 2002,14(2),161-168

5) Prenatal detection of chromosome disorders by QF-PCR,Adinolfi M.,Sherlock J.,Lancet 2001 ,358 (9287)1030-1

6) Rapid and simple prenatal diagnosis of common chromosome disorders:advantages and disadvantages of the molecular methods FISH and QF-PCR,Hulten M A,dhanjal S.,Pertl B.,Reproduction,2003,126(3),279-297

7) Prenatal diagnosis for chromosome abnormalities;past,present and future,Ogilvie CM,Pathol Biol 2003,156-160

8) Prenatal cytogenetic diagnosis,Miller WA,Peakman DC,J Med Screen 1999,6(1),1-2

9) Gregg’s congenital rubella patients 60 years later,J. Forrest,F. Turnbull,G. Sheller,r. Hawker,MJA vol 177,2002

10) The application of fluorescence in-situ hybridization to prenatal diagnosis,Pergament E.,Curr Opin Obstet Gynecol,2000,12(2),73-6

11) A rapid prenatal diagnosis of haemophilia A by DNA analysis crude chorionic villus biopsy,Acquila M,Bicocchi MP,Bottini F,Caprino D,Bonifacino O,Haematologica 1999,84(4),382-383

12) A one-step real-time PCR assat for rapid prenatal diagnosis sickle cell disease and detection of maternal contamination,Costa C.,Pissard S,Girondon E,Mol Diagn,2003,7(1),45-8

 

Autori: G. Borsaru, R.Colesniuc, H. Bumbea, D. Barbu, S. Predoi